FISH

一、FISH探针是个啥?

荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridization),简称FISH。 是采用荧光标记的DNA探针,利用探针与被检测样本DNA碱基对的互补性,在探针与样本的DNA杂交后,通过荧光显微镜检测荧光信号而得出结果,从而检测细胞,组织样本中的染色体或基因异常。

首先,我们知道需要检测的对象是DNA,而检测目标DNA所用的工具是用荧光染料做了标记的DNA,能够被观察到,这个就是FISH探针了。

荧光信号最终需要被肉眼观察到,而肉眼的分辨率是有限的,所以FISH探针的大小一般都比较长一点,多数有几百个kb。由于本身这个特点,FISH探针适用于检测染色体的断裂融合或者大片段的扩增、缺失或者染色体数目的变化,而不适用于突变检测。

以最常见的HER2产品为例,设计原理如下:

HER2基因位于17q11.2-q12,设计者把HER2探针标记为红色,使其能够覆盖HER2基因,同时,由于着丝粒相对保守,把相应位点标记为绿色作为对照。

设计者选择位点的差异以及工艺技术的差异则造成了不同探针敏感性和特异性的差异。

二、工欲善其事,必先利其器

目前市场上在售的FISH探针,颜色各不相同,那是因为标记的荧光素各不相同,主要的有以下几种:

荧光素 颜色 激发波长 发射波长
FITC 绿色 492 520
Cy3 橙色 550 570
TRITC 橙红色 550 620
Texas Red 红色 596 620
SpectrumOrange 橙色 559 588
SpectrumGreen 绿色 497 524
SpectrumAqua 青蓝色 433 480
DAPI 蓝色 367 452

荧光想被看到,需要被特殊光源激发后通过合适的滤光片才行,所以,探针生产商会在说明书上标明自己生产探针所使用的荧光素种类,然后建议“顾客使用探针前向滤片组供应商了解所使用的滤片组的详细情况,以便选择与标记荧光染料相适应的滤片组”。选择合适的滤光片是非常重要的,毕竟我们通过观察FITC的滤光片怎么也看不见Cy3不是?

以常见的奥林巴斯BX53显微镜为例(其他品牌也差不多),它的滤光单元长这样:

上图中手里拿着的小结构就是已经装了盒的滤光片。用来观察FISH实验结果的荧光显微镜,通常至少安装有3组滤光片,分别用来观察橙色、绿色以及蓝色的荧光。滤光片可以单独安装,所以,实验室如果已安装了荧光显微镜,那么在开展了新项目包含了新的荧光素种类时,拓展一个相应的滤色片就可以。

荧光显微镜中,除了滤色片,激发光源也需要注意,目前大多数荧光显微镜使用的是汞灯作为光源,而汞灯是有使用寿命的。所以,用了一段时间后,激发出的光变的弱了,老师,您的显微镜不是坏了,只是汞灯老了,换个嫩的就行。

FISH实验中,主要的仪器除了荧光显微镜,还有原位杂交仪:

原位杂交仪承担了探针和样本变性以及杂交的重任,可以提供精确且均一的温度。

原位杂交仪不仅可以用来进行荧光原位杂交的实验,也可以做原理类似的其他标记物(例如地高辛)标记的原位杂交实验。

三、标准化是有必要的

FISH操作的步骤好像每一家都不是很一样,它们之间的差异体现在哪儿?

其实,不论具体的步骤,FISH实验过程都可以被分成几个大的部分:

根据样本类型的不同,前期处理的方法也不同。目的在于保持组织细胞形态的完整,让细胞或者组织以最好的状态呈现在载玻片上。以最常见的石蜡样本为例,推荐的处理方法如下(这个大家区别不大):

常温下在10%中性福尔马林缓冲液中固定24小时,为了达到最佳和均匀的固定和石蜡包埋,样本大小不宜超过0.5cm3。标准操作和石蜡包埋,使用高质量的石蜡。渗透和包埋应在低于65℃下进行。切成4μm厚度的切片。切片捞于防脱玻片并在50~60℃环境中固定2~16小时。

预处理包括脱蜡、预处理、酶消化,目的在于把细胞核裸露出来、增加膜的通透性,让探针可以更好的进入细胞核与染色体DNA结合。由于各家探针生产商生产的探针敏感性和特异性有差异,对样本处理完的状态要求也不尽相同(比如:探针敏感性足够好,预处理的不是很好,探针也可以穿过核膜与染色体结合),所以预处理的条件会有一定的差异,各生产商所建议的预处理条件都是经过多次试验证明与其探针相适应的,因此建议实验过程中按照生产商提供的说明书进行操作。

同理,探针的变性和杂交的过程就是探针与目标DNA的结合过程,想要结合的好,就需要理想的化学和温度条件,而这个条件也是经过梯度实验最终确定的。

而杂交后洗脱的条件与变性杂交的条件有一定的关系,洗脱的温度与时间都与探针最终的结合情况相关,通俗来讲,如果结合的好,那么洗的厉害点也没关系,如果结合的不好,就得悠着点洗了。DAPI是一种能够与DNA强力结合的荧光染料,因为DAPI可以透过完整的细胞膜,所以在FISH实验中用于细胞核的复染。

综上,由于各家探针敏感性和特异性的不同导致的所有操作条件上的差异,都是系统性的,因此在实验过程中,并不建议不同生产商的探针和辅助试剂混用,按照说明书上的标准操作进行,有助于得到理想的实验结果。当然,如果您的实验室已经通过实验确定了自己的标准操作条件,就大胆的上吧。

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